uzupelnione pyt z inz[1]1 EDYTOWANA, Semestr IV, Inżynieria genetyczna

1. Synteza dsDNA pełnej długości odbywa się przy pomocy:
a) odwrotnej transkryptazy, DNAzy I, fragmentu Klenowa, ligaza (0)
b) odwrotnej transkryptazy, RNAzy H, fragmentu Klenowa, ligaza (1)
c) odwrotnej transkryptazy, nukleazy S, fragmentu Klenowa, ligaza (0)
d) odwrotnej transkryptazy, hydrolizy alkalicznej, fragmentu Klenowa (0)

2. Adaptory:
a) mogą być jednoniciowe (1)
(ale rzadko, jeżeli mamy do czynienia z lepkim końcami różnego typu wtedy możemy zastosować adaptory jednoniciowe. Te adaptory stanowią spinkę – mostek – łączący 2 końce o różnym charakterze)
b) mogą być dwuniciowe (1)   (przeważnie używa się dwuniciowych)
c) mogą wykazywać się niekomplementarnością (1)
d) mogą łączyć lepki koniec 5' z lepkim 3' (albo lepki 3' z lepkim 5') (1)

3. Fragment Klenowa polimerazy I E coli:
a) wykorzystywany w znakowaniu random priming (1) (inaczej metoda przypadkowych starterów)
b) ma aktywność egzonukleazy 5'-3' (0) (posiada aktywność egzonukleazy 3’–5’ i polimerazy 5’-3’.
W stosunku do enzymu wyjściowego jest pozbawiony aktywności egzonukleazy 5’-3’, jest ona bowiem kłopotliwa ze względu na to że, może degradować startery związane z matrycą jak również może usuwać grupę 5’-fosforanową z końców DNA, które później będziemy chcieli poddać ligacji)
c)wykorzystywany do znakowania schowanych 3' (1)
  (wypełnianie i znakowanie schowanych końców 3’ dsDNA)
d)w sekwencjonowaniu DNA (1) (ale tylko metodą dideoksypochodnych, przestarzała metoda)

Poza tym wykorzystywane też do syntezy drugiej nici cDNA i miejscowo-specyficznej mutagenezy z wykorzystaniem syntetycznych oligonukleotydów.

4. His Taq w białku rekombinantowym:
a) zwykle nie wpływa znacząco na jego strukturę, funkcje i właściwości (1)
    (spowodowane jest to małymi rozmiarami ogonka histydynowego tj. His Taq)
b) pozwala na jego oczyszczanie na złożu z tlenkiem fenyloarsenu (0)
(złożem do oczyszczania białka rekombinantowego jest kompleks Ni-kwas metylotrójoctowy sprzężony ze złożami o charakterze wielocukrowym. Złoża wielocukrowego z tlenkiem fenyloarsenu używa się do oczyszczania tylko jeżeli białko jest zfuzjowane z tioredoksyną)
c) stanowi sekwencję docelową dla enterokinazy (0)
d) umożliwia detekcję metodą Western Blot (1) (w przypadku białek rekombinantowych jest to metoda klasyczna, do detekcji tą metodą można wykorzystać przeciwciało antyhistydynowe)

5. Nick-translation inaczej metoda translacji nacięć, wykorzystywana do znakowania sond hybrydyzacyjnych.
Przebieg procesu:
wychodzimy od matrycy, która jest nadtrawiana niewielką ilością DNAzy I (generuje ona pewne nacięcia w  wyjściowej cząsteczce DNA).
Nacięcia te służą później jako miejsca primingu dla cząsteczek polimerazy I która w nie wchodzi i do końca 3’ dobudowuje nowe nukleotydy – do tego służy aktywność polimerazy 5’-3’.
Jeżeli substraty (deoksyrybonukleotydy), będą znakowane (haptenami lub izotopowo), to syntezowany odcinek DNA będzie wyznakowany. O translacji nacięć mówimy w tym przypadku dlatego, że synteza przez polimerazę I sprzężona jest z trawieniem nici DNA znajdującej się przed enzymem – nacięcie wygenerowane przez DNAzę I w wyniku aktywności polimerazy jest przesuwane wraz z jej aktywnością. Wytrawianie poprzedzającego odcinka DNA jest aktywnością analogiczną do wytrawiania starterów RNA
w czasie replikacji (5’-3’)

6. BAC'i (sztuczne chromosomy bakteryjne są to odpowiednio przekonstruowane plazmidy płciowe E.coli)
a) mogą występować w systemie binarnym (1)
(wtedy mówimy o BIBAC’ach czyli binary bacterial artificial chromosome)
b) pomieszczą insert do 1000 kb (0) (kodują b. duże odcinki DNA do ok. 350 kb, zazwyczaj 200kb)
c) w komórce występuję w formie liniowej (0) (BAC’i są koliste a YAC’i są liniowe)
d) wprowadza się je do komórki metodą elekrtotransfuzji (1) (prawda jeżeli elektrotransfuzja = elektroporacja)

BAC’i są wykorzystywane do konstrukcji bibliotek genomowych które służą do: izolacji określonych genów, mapowania fizycznego, sekwencjonowanie genomu. Klony w BAC’ach są często materiałem wyjściowym do syntezy sond dla eksperymentów FISH tzn. fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

7. Konsekwencją integracji wektora pMutin jest:
a) insercyjna inaktywacja genu docelowego (1)
(gen docelowy jest przerwany – sekwencja orf2 została insercyjnie inaktywowana)
b) podpięcie genu reporter. lacZ pod promotor znajdujący się powyżej miejsca integracji (1)
c) podpięcie sekwencji znajdujących się poniżej miejsca integracji pod promotor wektora (1)
d) otrzymanie szczepu mutanta, który można wykorzystać do badania funkcji genu (1)

8. YEp: (drożdżowe wektory episomalne)

a) zawierają drożdżowy marker selekcyjny (1) (taki jak: HIS3, LEU2, LYS2, TRP1, URA3. Markery te komplementują (uzupełniają) specyficzne mutacje auksotroficzne)

b) zawierają bakteryjny marker selekcyjny (0) (zawierają składnik bakteryjny ale nie marker)

c) mogą się namnażać w komórkach drożdżowych (1)

d) mogą się namnażać w komórkach bakteryjnych (1)
(mają charakter wahadłowy – oprócz tego że, że posiadają zdolność funkcjonowania w kom. drożdży, to mogą też replikować się autonomicznie w komórkach E. coli)

Należą do grupy wektorów, które replikują się autonomicznie.
Sekwencje występujące w nich to: składnik bakteryjny, klonowane DNA, drożdżowe markery selekcyjne, sekwencje pochodzące z plazmidu o nazwie 2μm.
YEp’y utrzymywane są w kilkudziesięciu kopiach na komórkę, w porównaniu z plazmidami integracyjnymi charakteryzują się obniżoną stabilnością. YEp’y wykorzystywane są do nadprodukcji białek rekombinantowych, nadają się do prowadzenia kultur na dużą skalę w różnego rodzaju fermentatorach.

9. T DNA (transformujące DNA) plazmidu Ti Agrobacterium:
a) zawiera odcinek flankujący (graniczny) prawą i lewą sekwencję (1)
(proste powtórzenia o długości 25 nukleotydów)
b) zawiera geny związane z formowaniem tumorów i katabolizowaniem opin (0)
(lewa sekwencja zawiera geny związane z formowaniem tumorów a prawa z syntezą opin,
natomiast geny katabolizujące opiny są poza T DNA)
c) zawiera geny wirulencji (0)
(geny wirulencji są w plazmidzie Ti Agrobacterium ale nie w T DNA tylko w regionie wirulencji VIR)
d) jest przenoszone do jądra (1) (bez przeniesienia do jądra proces nie zakończy się sukcesem z punktu widzenia bakterii. Przenoszenie do jądra zachodzi na zasadzie importu jądrowego)

Rekombinacja pomiędzy sekwencjami granicznymi T DNA a genomem ma charakter nieuprawniony
(nie istnieje homologia rekombinujących sekwencji).
To sprawia że, miejsce wbudowania T DNA do genomu rośliny jest nieswoiste.

10. Wektor binarny:

a) może się replikować w E. coli i u Agrobacterium (1) (ponieważ zawarte w nim ori RK2 funkcjonuje zarówno w E. coli jak i w Agrobacterium – ma zdolności autonomicznej replikacji u obu gospodarzy)
b) ma sekwencje homologiczną do Ti (1)
c) T DNA jest oflankowane sekwencjami granicznymi (1)

System binarny bazuje na plazmidzie przygotowanym w E. coli – budowa wektora binarnego:

·         sekwencje graniczne LB i RB pomiędzy którymi znajduje się miejsce klonowania MCS

oraz roślinny marker selekcyjny PTM (ta część znajdzie się w genomie komórki roślinnej),

·         bakteryjny marker selekcyjny RES,

·         ori RK2,

·         ori T – warunkuje transfer koniugacyjny.

Wektor binarny po przygotowaniu w E. coli wprowadzamy do Agrobacterium, przy czym plazmid ten w Agrobacterium może funkcjonować w postaci autonomicznej, ponieważ ma odpowiednie ori.
Szczep Agrobacterium również posiada plazmid (plazmid pomocniczy) który jest pochodną plazmidu Ti (nie posiada T DNA, posiada geny wirulencji). W systemie binarnym transgen jest obecny na innym plazmidzie (binarnym), a na innym są obecne geny wirulencji (pomocniczy) – czyli układ genu wirulencji w stosunku do transgenu ma układ trans.

11. Somatyczny transfer jądrowy:
a) pozwala na selekcje  in vitro na etapie zarodków (0) (in vitro przeprowadzamy selekcję fibroblastów, ze stabilnie wbudowanym transgenem, w efekcie dokonuje się wyboru odpowiedniej linii komórkowej)
b) wykorzystuje enukleowane oocyty (1) (przygotowane w warunkach in vitro fibroblasty poddaje się fuzji z enukleowanymi oocytami - czyli oocytami bez jader)
c) etapem jest mikroiniekcja do przedjądrzy męskich (0) (to jest całkiem odrębna metoda)
d) nie ma konieczności implantacji zarodków do organizmu biorczyni (0) (produkty fuzji fibroblastów z oocytami enukleowanymi prowadzi się w kulturze do stadium moruli lub blastuli po czym poddaje się je implantacji)

12. Rekombinacja z udziałem sekwencji lox P:
a) katalizowana jest przez drożdżową rekombinazę FLP (0) (enzymem, który przeprowadza rekombinację w obrębie miejsc Lox P jest rekombinaza Cre pochodzenia fagowego)
b) w układzie cis loxP ze zgodna orientacją następuje inwersja sekwencji zawartej miedzy nimi (0)
(w wyniku rekombinacji następuje delecja sekwencji zawartej między nimi)
c) w układzie cis lox P z niezgodną orientacja następuje delecja sekwencji (0)
(w wyniku rekombinacji następuje inwersja sekwencji)
d) ma charakter uprawniony (0)

Sekwencje Lox P to 2 miejsca DNA składające się z palindromowych sekwencji 13-nukleotydowych i sekwencji rdzeniowej 8-nukleotydowej, która określa orientację tej sekwencji – ma charakter kierunkowy. Oprócz 2 układów cis Lox P jest jeszcze układ trans gdzie miejsca te są na różnych cząsteczkach DNA a rekombinacja między nimi prowadzi do translokacji.

13. Do Vectorette PCR:

a) używamy starterów sekwencji znanej i adaptora (1)
b) startera sekwencji znanej i nieznanej (0)
c) startera sekwencji znanej i sekwencji homologicznej (0)
d) startera sekwencji znanej i zdegenerowanego (0)

Do Vectorette PCR używamy 2 starterów: startera specyficznego – przyłączającego się w obrębie sekwencji znanej i startera  posiadającego miejsce annealingu w obrębie kasety vectorette
(czyli adaptora)
 

14. RACE PCR:
a) tzn. technika szybkiej amplifikacji końców chromosomów (0)
(technika szybkiej amplifikacji końców cDNA)
b) położenie konkretnych genów (0)
(technika umożliwiająca otrzymanie pełnej długości sekwencji, gdy znany jest tylko fragment)
c) matryca to cDNA (1)
d) końce 2', 5' (0)
(są dwie wersje metody które odpowiadają różnym końcom cząsteczki cDNA : 3’ RACE i 5’ RACE )

15. Pytanie dotyczyło klonowania TA

Ta cloning bazuje na pewnej właściwości niektórych polimeraz termostablinych np. Taq, a mianowicie na ich cząstkowej aktywności terminalnej transferazy co oznacza że, niektóre polimerazy w sposób niezależny od matrycy do końca 3’ dodają nukleotydy adeninowe tworząc w ten sposób lepkie końce – końce adeninowe są wykorzystywane do klonowania TA. Wektor posiada analogiczne końce tymidynowe – jednonukleotydowe zazębienie wystarcza do tego, by stosunkowo wydajnie ligować produkty PCR z takim wektorem. Jeżeli klonujemy fragmenty restrykcyjne, to DNA klonowane jest ufosforylowane, w związku z tym można defosforylować wektor i mimo to ligacja zajdzie. Jeżeli natomiast klonujemy produkty PCR to DNA nie jest ufosforylowane, dlatego przy klonowaniu TA nie można zastosować defosforylowanych wektorów – ponieważ nie połączymy cząstek. Konsekwencją tego jest znaczne tło klonów nierekombinowanych czyli mała wydajność procesu.

16. Hybrydyzacja różnicowa:
a) służy do klonowania genów o różnej lokalizacji (0)
b) służy do klonowania genów o różnym fenotypie (1)
c) służy do wykrywania specyficznych transkryptów dla danej linii komórek (1)
d) żadna z powyższych odpowiedzi nie jest prawidłowa (0)

17. Metoda cDNA AFLP: (polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów cDNA)
a) ma mniejszą czułość niż hybrydyzacja plus/minus różnicowa (0)
b) stosujemy do syntezy ds DNA (1)

c) startery dobudowują się z sekwencja 3' (0)
d) wykorzystujemy dwustopniowa amplifikację (1) (preamplifikacja i amplifikacja selektywna)

19. Do pozycyjnego klonowania genu metodą spaceru po chromosomie wykorzystuje się:

A) informacje w markerach molekularnych

B)biblioteki genomowe w wektorach BAC lub YAC

C) sondy.....
mapę zintegrowaną – mamy na niej gen w otoczeniu sprzężonych loci dla markerów molekularnych, bibliotekę genomową uszeregowaną – tzn. musimy dysponować kolekcją klonów bakteryjnych lub drożdżowych z których każdy zawiera określoną porcję genomu i którego lokalizację w obrębie biblioteki znamy.  Ograniczenia chromosome walking: obecność sekwencji powtarzalnych (może prowadzić to tzw. walka zbłądzonego) i obecność sekwencji nieklonowalnych (prowadzi do walka zatrzymanego).

20. Biblioteki linking (sprzęgające):

A) ?pozwalają na klonowanie? krótki odcinków w pobliżu miejsca restrykcyjnego

B) tworzy sie w sposób... (taki jak sie naprawdę tworzy)

C)

D)Pozwalają uniknąć problemów spowodowanych przez sekwencje nieklonowane i powtarzalne

Nie reprezentują całości genomu, ale pewną frakcję, którą stanowią sekwencje otaczające miejsce trawienia enzymu rzadkotnącego: Procedura przygotowania biblioteki: wychodzimy od DNA genomowego, które na początku trawimy częściowo enzymem gęsto tnącym. W wyniku trawienia powstaje wiele małych kawałków. Produkty trawienia cyrkularyzuje się w obecności odcinka DNA, który zawiera marker selekcyjny. Produkty ligacji są cząsteczkami kolistymi ze spułapkowanym odcinkiem DNA zawierającym marker selekcyjny. Produkty ligacji poddaje się trawieniu enzymem rzadkotnącym, w efekcie czego otrzymuje się małą frakcję cząsteczek zlinearyzowanych. Fragmenty zlinearyzowane będą klonowane w wektorze fagowym lub kosmidowym który zawiera komplementarny marker selekcyjny do wcześniej stosowanego. Po wysianiu biblioteki otrzymamy klony zawierające marker selekcyjny (zligowany) otoczony przez sekwencje flankujące miejsce trawienia. Użycie w technice chromosome jumping bibliotek typu jumping i linking pozwala wyeliminować trudności związane z sekwencjami nieklonowalnymi i powtórzonymi. Posiadanie zidentyfikowanych ciągów klonów skaczących i sprzęgających pozwala za ich pomocą wrócić do biblioteki standardowej i wyizolować kompletne sekwencje.

21. Drożdżowe systemy dwuhybrydowe:

a) na podstawie tej techniki możemy mieć informację o sekwencji DNA (0)
(mamy tylko informację o genach kodujących białka)

b) czy DBD wiąże się z przynętą (1) (ekspresja wektora prowadzi do powstania białka fuzyjnego – jedna jego część odpowiada przynęcie, a druga – domenie DBD)
c) czy AD wiąże się z zdobyczą (1) (PRAY-AD)
d) czy między przynętą a zdobyczą wiązanie jest kowalencyjne (0) (oddziaływanie niekowal.)

e) wykorzystanie białka zawierającego domenę AD (domenę aktywującą) i  wiążącego się z przynętą (0) (AD wiąże się z Prey czyli częścią rekombinantową)
f) wykorzystanie białka zawierającego domenę DBD (wiążącą DNA) i będącego przynętą (0)
(to białko nie jest przynętą tylko się z nią wiąże)
 

Oddziaływanie między DNA a DBD ma charakter oddziaływania niekowalencyjnego natomiast oddziaływanie między DBD a wabikiem oraz oddziaływanie zdobycz-domena aktywująca (PREY – AD) maja charakter kowalencyjny.

22. Touchdown PCR:

A) temperatura idzie do góry

B) używamy startera arbitralnego

C) polimerazę dodajemy pod warstwą wosku

D)

23. W metodzie real time PCR współczynnik CT to:
a) współczynnik CT określa cykl (nr cyklu) w którym wartość fluorescencji przekracza wartość progową (0) (określa cykl w którym wartość fluorescencji osiąga a nie przekracza wartość progową)
b) wartość ta daje informacje o tym ile kopii docelowej sekwencji dostarczono z matrycą do reakcji (1)

W metodzie tej wykorzystujemy zależność, jaka istnieje między liczbą kopii docelowej sekwencji w wyjściowym preparacie matrycy a ilością amplifikowanego produktu w danym cyklu – im więcej docelowej sekwencji tym silniejszy produkt na danym etapie PCR. Technika ta bazuje na obserwacji poziomu amplifikacji poprzez śledzenie natężenia fluorescencji odpowiadającej amplifikowanemu produktowi (które jest pochodną stężenia produktu). Stosuje się różne badania dla powiązania ilości produktu z fluorescencją np. zastosowanie barwnika CYBERGreen lub sondy TaqMan.

24. Pirosekwencjonowanie:

a) coś o luminescencji

b) czy nukleotydy są dodawane do reakcji po kolei

c) coś o fluorescencji

d) czy usuwamy nadmiar ATD i dNTP-ów

opiera się na wykorzystaniu 3 reakcji: syntezy DNA – primer pod wpływem polimerazy będzie miał przyłączony nukleotyd w związku z tym będzie wydłużał się on o ten nukleotyd a jako produkt uboczny powstanie pirofosforan który jest wykorzystywany do detekcji zdarzenia inkorporacji (włączenia nowego nukleotydu). W kolejnej reakcji którą katalizuje enzym sulfunylaza, pirofosforan ulega konwersji w ATP. ATP jest konsumowane przez lucyferazę w reakcji utleniania lucyferyny, a produktem ubocznym tej reakcji jest błysk światła, który może być zarejestrowany przez odpowiedni detektor
(mamy do czynienia z chemiczną  luminescencją).
Jeżeli podczas przebiegu procesu podany jest właściwy nukleotyd – zgodny z matrycą, to jest on włączany, ale istnieje konieczność usunięcia nadmiaru substratu – nukleotydów niewbudowanych oraz tych nukleotydów, które były niezgodne z matrycą w danym momencie.

25. W toku testu opóźnienia w żelu (band shift assay):
a) białko oddziałujące z DNA zabezpiecza przed trawieniem przez DNazę I (1)
b) dodanie DNA niewyznakowanego ma konkurować z DNA wyznakowanym o wiązanie z białkiem i powoduję że sygnał jest słabszy (1)
c) pytanie o tożsamość oddziałującego z DNA białka
d) superopóźnienie migrującego kompleksu osiągamy poprzez dodatek współpracującego z sondą oligonukleotydu (0)

26. RNAse protection assay:

czy bardziej czuła od northern

Obejmuje uzyskanie sondy antysensownej, która powstaje w reakcji transkrypcji in vitro na bazie sklonowanego fragmentu DNA, który otoczony jest przez odpowiednie promotory fagowe.
Otrzymane sondy są w roztworze hybrydyzowane z preparatem RNA badanych.
Hybrydy są następnie obtrawiane RNAzą trzustkową i tylko perfekcyjnie dopasowane rejony pomiędzy sondą a badanym RNA przetrwają trawienie. Żeby metoda pracowała w sposób ilościowy trzeba do hybrydyzacji zastosować nadmiar sondy (tak by wysycać całą możliwą pulę docelowych cząsteczek). Zaletami tej metody są: wysoka czułość – ale nie aż taka jak RT-PCR, hybrydyzacja w roztworze zachodzi wydajniej niż na błonach, mniejsze niż w Northern wymagania co do jakości preparatu, wygodne jest analizowanie wielu docelowych cząsteczek RNA jednocześnie – w przeciwieństwie do Northern – na jednym żelu można analizować ekspresję różnych genów poprzez zastosowanie różnych sond.
Wady: tracimy informacje o wielkości transkryptu, gdyż jego końcowe rejony oraz sondy są obtrawiane działaniem nukleolitycznym, wymagana jest bezwzględna homologia pomiędzy sondą i docelową cząsteczką.

27. W metodzie FAR WESTERN:

A) sondą jest zawsze przeciwciało dla danego białka (0)

B)białka mogą być przygotowywane podobnie jak w metodzie western blot (?)

C)sondy białkowe mogą być wykorzystywane w sekwencjonowaniu..... (0)

D)możemy poznać tożsamość badanego białka (1)

28. Forward genetics [odwrotna genetyka]

A) Punktem wyjścia dla... charakterystyki docelowego genu jest fenotyp molekularny

B)Punktem wyjścia jest... gen, który poddaje się mutacji w celu poznania jego funkcji

C)Mozna wykorzystać... funkcjonalne fenokopie zmutowanych...

D)

29.Proteomika

30. Przy konstrukcji bibliotek genomowych:
a) stosujemy elektroforezę pulsową (1)
b) duża pojemność wektora zmniejsza szanse na znalezienie docelowej sekwencji (1)

c) bazu...