|
Nie obrażaj więc mojej inteligencji poprzez czynione na pokaz zaniżanie własnej.
DRÓB
mgr Grzegorz Woźniakowski, prof. dr hab. Elżbieta Samorek-Salamonowicz, dr n. wet. Wojciech Kozdruń, dr n. wet. Hanna Czekaj Zakład Chorób Wirusowych Drobiu, Państwowy Instytut Weterynaryjny, Państwowy Instytut Badawczy Diagnostyka choroby Mareka Choroba Mareka (MD) jest wirusową, nowotworową chorobą drobiu. Wraż- liwe na zakażenie są kurczęta, indy- ki oraz przepiórki japońskie. Stanowi ona poważny problem ekonomiczny w masowej hodowli drobiu. Szacuje się, że straty spowodowane jej występowa- niem w skali światowej wynoszą od 1 do 2 mld dolarów rocznie (13). Z tego wzglę- du MD umieszczono na liście B Świato- wej Organizacji Zdrowia Zwierząt (OIE) oraz w wykazie Ustawy weterynaryjnej z 1997 roku, podlega ona obowiązkowi rejestracji (12, 15). Choroba Mareka jest pierwszą choro- bą nowotworową zwalczaną przez szcze- pienia ochronne, dlatego też stanowi prototyp dla rozwoju nowoczesnej wak- cynologii oraz walki z nowotworami, nie tylko u zwierząt, ale i ludzi (1, 11). Czynnikiem etiologicznym MD jest wirus należący do rodziny Herpesviri- dae , zwany wirusem choroby Mareka (MDV). Genom MDV stanowi liniowa, dwuniciowa cząsteczka DNA o wielko- ści około 185 kbp, która posiada dużą homologię z innymi herpeswirusami wy- stępującymi u zwierząt i ludzi, takimi jak: BHV-1, HSV-1 i EBV (14, 16, 17). Wirus jest ściśle związany z zakażoną komórką organizmu gospodarza. Znane są 3 sero- typy tego wirusa, ale jedynie szczepy na- leżące do serotypu 1 powodują objawy chorobowe i powstawanie zmian nowo- tworowych w narządach wewnętrznych. W zależności od patogenności szcze- pów należących do serotypu 1 wyróżnia- ne są cztery patotypy: mMDV – o niskiej patogenności, vMDV – o umiarkowa- nej patogenności, vvMDV – o wysokiej patogenności, oraz vv+MDV – o wy- sokiej patogenności, które przełamują odporność poszczepienną (16). Wirus MD może w pełni kontrolować proce- sy podziałów komórkowych, co prowa- dzi w przypadku szczepów zjadliwych MDV serotypu 1 do powstawania zmian nowotworowych w narządach wewnętrz- nych zakażonych ptaków. W przypadku masowego chowu kurcząt brojlerów lub indyków stwierdzenie obecności zmian nowotworowych w narządach wewnętrz- nych oraz tuszkach mięsnych skutkuje ich konfi skatą. Profi laktyka choroby Mareka sprowa- dza się głównie do szczepienia kurcząt 1-dniowych lub zarodków kurzych meto- dą in ovo szczepionkami przeciwko cho- robie Mareka zawierającymi apatogenne szczepy herpeswirusa indyków (HVT), apatogenne szczepy wirusa MD należą- cego do serotypu 2 (SB-1, 301B/1) oraz atenuowane szczepy należące do se- rotypu 1 MDV (CVI988 Rispens). Sto- sowane są również szczepionki biwa- lentne i trójwalentne (CVI988+HVT i CVI988+SB-1+HVT). Szczepionki opar- te są głównie na żywych szczepach szczepionkowych namnażanych w ho- dowlach komórkowych, przechowywa- nych w temperaturze ciekłego azotu (-196°C), przez co są wrażliwe na zbyt długie rozmrażanie czy przechowywa- nie w temperaturze pokojowej (2). Do- datkowo należy pamiętać, że pomimo szczepienia nie dochodzi do eradyka- cji wirusa z organizmu ptaków i otocze- nia. Szczepienia chronią jedynie przed wystąpieniem objawów chorobowych. Szczepione ptaki pozostają wrażliwe na zakażenie zjadliwym szczepem wiru- sa choroby Mareka i są siewcami wirusa zjadliwego do otoczenia. W cząstkach kurzu i pyłu pomieszczeń hodowlanych wirus MD może pozostawać zakaźny od 1 roku aż do 10 lat (17). Dlatego inny- mi bardzo ważnymi czynnikami wpływa- jącymi na powodzenie w hodowli drobiu Streszczenie Choroba Mareka (MD) jest wiruso- wą i nowotworową chorobą drobiu. Jest ona źródłem poważnych strat w wielkostadnym chowie drobiu. Jej czynnikiem etiologicznym jest her- peswirus, zwany wirusem choroby Mareka (MDV). Wirus ten jest ściśle związany z komórką organizmu gospodarza. Znane są 3 serotypy tego wirusa, ale tylko szczepy nale- żące do serotypu 1 są patogenne. W ostatnich latach obserwuje się wzrost zakażeń i przełamywanie odporności poszczepiennej przez szczepy MDV o podwyższonej pa- togenności. Istotną częścią profi - laktyki choroby Mareka jest szybkie wykrywanie obecności wirusa zjadli- wego u chorych ptaków. Słowa kluczowe choroba Mareka, metody diagno- styczne Abstract Marek’s disease (MD) is a viral and tumorous disease of poultry. The disease cause a serious losses in mass poultry production. The etio- logical agent of the disease is the herpesvirus called Marek’s disease virus (MDV). MDV is strongly associa- ted with the host’s cell. Three sero- types of the virus are known but the oncogenic properties are associated only with strains belonging to the 1 st serotype. During the last years the increase of MD cases as well as pro- tection breaks after vaccination by highly pathogenic MDV-1 strains are observed. An essential part of MD prophylactics is a rapid detec- tion of the presence of virulent MDV fi eld strains among birds. Key words Marek’s disease, laboratory dia- gnostics WETERYNARIA W TERENIE y 2/2009 y 17 DRÓB grzebiącego są: prawidłowo prowadzo- na dezynfekcja oraz przestrzeganie za- sad higieny hodowli. Innym poważnym problemem ostatnich lat stały się szcze- py MDV o podwyższonej patogenności (vv+MDV-1), które przełamują odpor- ność poszczepienną. Fakt ten wiąże się z ciągłą ewolucją wirusa i powstawaniem szczepów o coraz wyższej patogenno- ści (16). W wielu ośrodkach na świecie, w tym również w Polsce w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym, trwają ba- dania nad możliwością wykorzystania nowych szczepionek DNA opartych na sztucznym chromosomie bakteryj- nym (BAC) zawierającym kompletny genom MDV i próbą ich zastosowania w profi laktyce choroby Mareka. Równie istotną częścią profi laktyki jest diagno- styka laboratoryjna i wykrywanie obec- ności wirusa w stadach hodowlanych, co pozwala na podjęcie odpowiedniego postępowania i przynajmniej w pewnym stopniu ograniczenie i tak ogromnych strat (13). todą PCR wykrywana jest obecność wirusa w końcówkach (dudkach) piór. Należy zwrócić uwagę, że do badania serologicznego nadają się pióra świe- że, zawierające w dudkach komórki bro- dawek piór, które mieszczą kompletne cząstki MDV. Podczas badania sekcyj- nego poszukiwane są zmiany anato- mopatologiczne charakterystyczne dla zakażenia wirusem choroby Mareka. Zalicza się do nich m.in. powiększenie śledziony, wątroby, żołądka gruczołowe- go, atrofi ę torby Fabrycjusza, wybroczy- ny w nerkach i płucach oraz obecność guzów nowotworowych w wymienio- nych narządach. Jedna część pobranych wycinków narządów wewnętrznych kie- rowana jest do badania histopatologicz- nego, natomiast z drugiej części spo- rządzane są homogenizaty w buforze fosforanowym, które następnie służą do inokulacji zarodków SPF, hodow- li komórkowych oraz do izolacji DNA i badań molekularnych. Podczas ba- dania histopatologicznego poszukuje się nacieków proliferujących komórek limfocytarnych i makrofagów, obrzę- ków nerwów obwodowych z naciekiem komórek plazmatycznych i rozrostów nowotworowych (14, 16). W zależno- ści od rodzaju naciekających komórek zmiany histopatologiczne charaktery- styczne dla choroby Mareka określa się jako typ A, B lub C. Do metod moleku- larnych stosowanych w diagnostyce tej choroby zalicza się łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) oraz jej odmianę z po- miarem amplifi kacji produktów w czasie rzeczywistym, czyli Real-time PCR. z zakażonych hodowli komórkowych. Antygen wprowadzany jest do centralnej studzienki w żelu agarowym, natomiast surowica standardowa oraz badane su- rowice wprowadzane są do studzienek ułożonych dookoła studzienki central- nej, przez co całość tworzy układ rozety (ryc. 2). Płytki szklane z żelem agarowym i dodanymi surowicami oraz antygenem inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 24-48 h. Za wynik dodatni uzna- je się występowanie linii precypitacyj- nych pomiędzy antygenem a surowicą standardową i badanymi surowicami. Odczyn ten ma jednak pewne ograni- czenia, ponieważ przeciwciała mogą być wykrywane u zakażonych ptaków od 2. do 4. tygodnia po zakażeniu. Innym testem serologicznym stosowa- nym do wykrywania obecności antyge- nu wirusa choroby Mareka jest odczyn immunodyfuzji radialnej w żelu agaro- wym (RID). Podobnie jak w przednio omówionej metodzie odczyn opiera się na reakcji antygen – przeciwciało. Za- sada stosowania tej metody opiera się na wykrywaniu antygenu MDV w koń- cówkach (dudkach) piór, pobranych w liczbie 10-20 sztuk od chorych ptaków. Do 1% żelu agarowego dodaje się suro- wicę standardową o mianie 1:8. Koń- cówki piór wkłuwa się w warstwę żelu agarowego. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 24-48 h w przypadku wystę- powania cząstek wirusowych wokół koń- cówek piór pojawiają się pierścienie pre- cypitacyjne, co uznawane jest za wynik dodatni. Podobnie jak poprzednia me- toda serologiczna, również metoda RID pozwala na wykrywanie antygenu MDV dopiero po 11-14 dniach od zakażenia. Metody diagnostyczne Podstawą wszystkich badań diagno- stycznych jest obserwacja objawów kli- nicznych oraz wywiad z hodowcą lub lekarzem prowadzącym, co pozwala na ustalenie warunków hodowlanych i kondycji badanego stada ptaków. Do badań powinny być przysyłane żywe ptaki, ze względu na bardzo ści- sły związek wirusa MD z komórką go- spodarza. Jest to istotne, ponieważ wraz ze śmiercią komórki ginie również wi- rus. Do specyfi cznych objawów klinicz- nych występujących u ptaków chorych na chorobę Mareka zalicza się obu- stronny paraliż kończyn (ryc. 1.) (posta- wa szpagatu), kręcz szyi oraz rzadziej np. zmętnienie tęczówki oka. Wystę- pują również mniej specyfi czne obja- wy, tj. osłabienie, zmniejszone pobie- ranie paszy i wody, bladość dzwonków i grzebienia u kurcząt. Od ptaków przysłanych do badań po- bierana jest krew, w której wykrywana jest obecność specyfi cznych przeciwciał anty-MDV. Po odwirowaniu krwi i zebra- niu warstwy kożuszka limfocytów ( buffy coat ) zakażane są hodowle komórkowe fi broblastów zarodków kurzych (CEF) lub komórek nerki zarodków kurzych (CEK) (3). Od chorych ptaków pobiera- ne są również pióra ze szlaku barkowe- go oraz zewnętrznej powierzchni uda, w których testem serologicznym i me- Metody serologiczne Testy serologiczne stosowane w diagno- styce choroby Mareka polegają na wy- krywaniu przeciwciał poliklonalnych anty-MDV w surowicy krwi lub antyge- nu wirusa produkowanego w brodaw- kach piór chorych ptaków. Przeciwciała te produkowane są głównie przeciwko antygenowi A MDV. Występują również przeciwciała anty-AgB oraz anty-AgC. Jednym z testów serologicznych wykry- wających przeciwciała po zakażeniu MDV jest odczyn immunodyfuzji w żelu agarowym (AGID). W teście tym wyko- rzystuje się właściwość tworzenia kom- pleksów (precypityn) pomiędzy anty- genem a specyfi cznymi przeciwciałami w żelu agarowym. Do testu wykorzysty- wany jest antygen sporządzony z homo- genizatów skóry zakażonych ptaków lub Metody wirusologiczne Izolacja wirusa choroby Mareka na za- rodkach kurzych SPF jest czułą metodą diagnostyczną. Izolację wirusa przepro- wadza się na 4-5-dniowych zarodkach kurzych SPF zakażanych dożółtkowo. Jako inokulum stosuje się homogenizaty z wycinków narządów wewnętrznych po- brane od chorych ptaków. Po 9 dniach inkubacji w temperaturze 37,8°C zarod- ki są uśmiercane i poszukiwane są zmia- ny anatomopatologiczne na błonach kosmówkowo-omoczniowych. Zmiany te są widoczne jako guzki wielkości głów- ki od szpilki. Za wynik dodatni przyjmu- je się wystąpienie tego typu zmian u mi- nimum 30% inokulowanych zarodków. Metoda ta, pomimo dużego nakładu WETERYNARIA W TERENIE y 2/2009 y 18 DRÓB pracy, jest bardzo dobra, potwierdza wy- nik uzyskiwany metodami: sekcyjną, se- rologicznymi i molekularnymi. Podobnie jak w przypadku izolacji na zarodkach kurzych, często stosowana jest izolacja wirusa w hodowli fi brobla- stów zarodków kurzych (CEF) oraz ko- mórek nerki zarodków kurzych (CEK). Hodowle te wykonuje się z zarodków kurzych SPF w 9.-11. dniu inkubacji w przypadku hodowli CEF oraz w 18.- -19. dniu inkubacji w przypadku ho- dowli CEK. Do inokulacji hodowli służą homogenizaty wycinków narządów we- wnętrznych. Obecność wirusa choroby Mareka identyfi kuje się na podstawie pojawiania się efektu cytopatycznego (CPE) w zakażonych hodowlach w 3.- -7. dniu po zakażeniu. Początkowo oko- ło 3. dnia po inokulacji obecność wirusa w hodowlach komórkowych manifestuje się pojawieniem się okrągłych komórek silnie załamujących promienie świetlne (3). Wraz z upływem czasu zakażone ko- mórki tworzą ogniska (fokusy) (ryc. 3), które, odrywając się od ścianek naczy- nia hodowlanego, składają się na cha- rakterystyczne łysinki (plaki). Kształt, rozmiar i czas, po którym w hodowlach komórkowych powstają łysinki, pozwala na identyfi kację poszczególnych seroty- pów MDV. W hodowlach komórkowych CEF największe łysinki, które pojawiają się najszybciej, tworzą szczepy MDV na- leżące do serotypu 3 (HVT), natomiast najmniejsze, które pojawiają się najpóź- niej, tworzą zjadliwe szczepy należące do serotypu 1. Na podstawie liczby łysi- nek oznacza się miano infekcyjne szcze- pu w jednostkach PFU ( Plaque Forming Unit ), w których również oznaczane jest miano wielu komercyjnych szczepionek przeciwko chorobie MD. Serotyp wi- rusa MD może być również określony na podstawie odczynu immunofl uore- scencji pomiędzy powstałymi łysinkami a swoistymi dla danego szczepu przeciw- ciałami monoklonalnymi znakowanymi fl uoroscencyjnie. Ograniczeniem meto- dy izolacji wirusa w hodowlach jest czas przygotowania i wykonania badania, który wynosi do 18-28 dni, ze względu na konieczność przygotowania hodow- li z zarodków kurzych SPF w odpowied- nim dniu inkubacji. Na zarodkach kurzych SPF oraz w ho- dowlach komórkowych oznaczane jest również miano EID 50 ( embryo 50% in- fectious dosis ) oraz TCID 50 ( tissue colo- ny 50% infectious dosis ). W kolejnych rozcieńczeniach materiału wirusowego (od 10 -1 do 10 -5,4 ) użytego do inokulacji grupy zarodków lub hodowli komórko- wych poszukuje się zmian anatomopa- tologicznych lub obecności efektu cy- topatycznego. Na podstawie wyników uzyskanych z obserwacji zarodków lub hodowli oblicza się miano dla danego szczepu wirusa MD (10). Podobnie jak w przypadku hodowli komórkowych, w metodzie tej czas potrzebny na wyko- nanie badania jest dosyć długi. Metodą wirusologiczną wykorzystu- jącą właściwość zobojętniania cząstek wirusowych przez specyfi czne przeciw- ciała anty-MDV zawarte w surowicy stan- dardowej jest odczyn seroneutralizacji (SN). Metoda ta wymaga dostępności Ryc. 1. Objawy kliniczne choroby Mareka u 5-tygo- dniowych kurcząt rasy White Leghorn (Lohmann). Widoczny paraliż obu kończyn dolnych Ryc. 2. Odczyn immunodyfuzji w żelu agarowym (AGID). Wykrywanie obecności przeciwciał w suro- wicach ptaków. Widoczne linie precypitacyjne utwo- rzone pomiędzy antygenem a surowicą standardową i surowicami badanymi Ryc. 3. Efekt cytopatyczny w hodowli komórek CEF 5 dni po zakażeniu wirusem terenowym MDV nale- żącym do serotypu 1. Widoczne ogniska zakażonych komórek. Pow. 8 x 20 Delta Rn vs Cycle 1.0e+001 1.0e+000 1.0e-001 1.0e-002 1.0e-003 1.0e-004 1.0e-005 1.0e-006 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Cycle Number Ryc. 4. Real-time PCR dla genu ICP4 MDV. Określanie dokładnej liczby kopii MDV. Krzywe fl uoroscencyjne dla próbek zawierających DNA szczepów terenowych wirusa choroby Mareka WETERYNARIA W TERENIE y 2/2009 y 19 DRÓB zarodków kurzych SPF lub hodowli ko- mórkowych. Zarodki lub hodowle dzieli się na 3 grupy: inokulowane mieszaniną wirusa i surowicy, inokulowane materia- łem wirusowym z buforem fosforano- wym oraz samą surowicą standardową ujemną, nie posiadającą przeciwciał an- ty-MDV. W przypadku obecności wirusa MD zmiany anatomopatologiczne lub efekt cytopatyczny występują w grupie zakażonej materiałem wirusowym, na- tomiast brak zmian i efektu cytopatycz- nego w grupie, której podano materiał wirusowy i surowicę. Odczyn seroneu- tralizacji pozwala również na określa- nie indeksu neutralizacji (NI) badanego szczepu wirusa przy stałej dawce suro- wicy standardowej oraz malejącym roz- cieńczeniu wirusa lub przy stałej dawce wirusa i malejącej dawce surowicy (10). do badań w kierunku choroby Mareka metodą PCR przysyłane są ptaki szcze- pione, u których istnieje podejrzenie choroby po zakażeniu szczepem zja- dliwym. Zazwyczaj hodowcom chodzi o odpowiedź na pytanie, czy po szcze- pieniu w organizmie ptaków obecny jest wirus szczepionkowy i czy doszło do zakażenia szczepem zjadliwym. Jed- na z modyfi kacji metody PCR pozwala na łączenie kilku reakcji i opracowanie Multiplex PCR do wykrywania tereno- wych szczepów MDV i szczepów szcze- pionkowych w jednej reakcji (4, 6, 8, 9). Multiplex PCR pozwala na skrócenie czasu wykonania badania oraz podanie ostatecznych wyników. W badaniach prowadzonych nad chorobą Mareka na całym świecie stosowana jest rów- nież metoda PCR w czasie rzeczywi- stym. Real-time PCR charakteryzuje się jeszcze większą czułością i swoistością w stosunku do tradycyjnej PCR. Prze- prowadzenie badania wymaga jednak zakupu kosztownego aparatu do amplifi - kacji sprzężonego ze spektrofotometrem oraz użycia odpowiednich odczynników. W metodzie tej pomiar przyrostu licz- by kopii wykrywanego genu następuje w każdym cyklu reakcji, przez co możli- we jest dokładne określenie początkowej liczby kopii wirusowego DNA w każdej z badanych próbek (ryc. 4). Rejestracja emisji sygnału fl uoroscen- cyjnego powstającego w trakcie trwania reakcji jest możliwa dzięki zastosowaniu barwników interkalarnych łączących się z powstającymi dwuniciowymi cząstecz- kami DNA, np. SYBRGreen i EvaGreen, lub też stosowane są krótkie sondy oli- gonukleotydowe znakowane fl uoroscen- cyjnie, np. Taqman lub Scorpion o se- kwencji komplementarnej do sekwencji genomu MDV. Pomimo wielu zalet tej metody jest ona nadal zbyt kosztowna, by ją rutynowo stosować w laboratorium diagnostycznym. Porównując metody wykorzystywane w laboratorium Zakładu Chorób Wiruso- wych Drobiu PIWet-PIB do diagnostyki choroby Mareka, należy zwrócić uwagę, że różnią się one czułością oraz moż- liwościami ich zastosowania. W przy- padku większości metod konieczne jest przysłanie do badań żywych pta- ków ze względu na ścisły związek wiru- sa MD z komórką gospodarza. Metoda badania sekcyjnego stanowi bardzo waż- ny punkt każdego badania w kierunku choroby Mareka, jednak jej wyniki po- winny być potwierdzone przy użyciu metod serologicznych, takich jak AGID i RID, oraz metody molekularnej – PCR. PCR posiada najwyższą czułość i zdol- ność do wykrywania wczesnych zakażeń ze względu na stosunkowo dużą licz- bę kopii cząsteczek wirusowego DNA w narządach wewnętrznych chorych pta- ków po zakażeniu MDV. Nadal bardzo istotnym czynnikiem potwierdzającym obecność wirusa terenowego jest jego izolacja na zarodkach kurzych SPF lub w hodowlach komórkowych. Podsumowanie Wirus choroby Mareka stanowi wciąż poważny problem w masowej produk- cji drobiarskiej. Pomimo prowadzonych szczepień ochronnych poważnym zagro- żeniem są zakażenia powodowane przez szczepy terenowe MDV o podwyższo- nej patogenności, które mogą przełamy- wać odporność po szczepieniu. Jedną z istotnych części zapobiegania chorobie Mareka jest szybkie wykrywanie jej wy- stępowania, co pozwala na podjęcie od- powiednich środków zaradczych. Do me- tod diagnostycznych stosowanych przez laboratorium referencyjne w PIWet-PIB zalicza się badanie sekcyjne i histopato- logiczne, odczyny serologiczne (AGID i RID), metody wirusologiczne (izolacja wirusa na zarodkach kurzych SPF, ho- dowle komórkowe, odczyn seroneutrali- zacji) oraz metody biologii molekularnej (PCR i Real-time PCR). Metody te są zale- cane przez Międzynarodową Organiza- cję Zdrowia (OIE) i pozwalają na pewną diagnostykę choroby Mareka, określa- nie skuteczności szczepionek wprowa- dzanych do obrotu handlowego oraz wykrywanie zakażeń MDV u ptaków po szczepieniu. Pomimo wielu zalet każ- da z wykonywanych metod ma również pewne ograniczenia, dlatego istotne jest potwierdzenie wyników uzyskiwanych z badania sekcyjnego czy metody sero- logicznej metodami wirusologicznymi i molekularnymi. Diagnostyka choroby Mareka jest bardzo istotną częścią zapo- biegania i walki z tą chorobą ze względu na aspekty epizootyczne, decydujący wpływ na postępowania sądowe i admi- nistracyjne oraz dopuszczenie zwierząt hodowlanych do obrotu krajowego i za- granicznego. Metody molekularne Coraz częściej w diagnostyce choroby Mareka wykorzystuje się metody mo- lekularne, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) oraz PCR w czasie rzeczywistym (5). Jako matrycę do PCR wykorzystuje się całkowite DNA izolowa- ne z krwi, wycinków narządów wewnętrz- nych, końcówek piór, a nawet z kurzu po- mieszczeń, w których przetrzymywane są ptaki. Tradycyjna metoda PCR polega na powielaniu fragmentu genu specy- fi cznego dla wirusa MD. Do powielenia wybranego fragmentu stosuje się krót- kie 20-nukleotydowe oligonukleotydy (startery) o sekwencji komplementarnej do sekwencji genomu MDV. Przygotowa- nie reakcji oraz analiza wyników wymaga- ją znacznie mniej nakładu pracy i czasu w porównaniu do metod wirusologicz- nych i serologicznych. Zaletą metod mo- lekularnych jest ich wysoka czułość i spe- cyfi czność. Wysoka specyfi czność PCR pozwala na różnicowanie szczepów zja- dliwych należących do serotypu 1 oraz szczepów szczepionkowych należących do serotypu 3 (HVT), serotypu 2 i atenu- owanych szczepów należących do seroty- pu 1 (CVI988 Rispens) (7). Czułość PCR pozwala z kolei na wykrywanie od 100 kopii DNA wirusa MD w 25 mg prób- ki pobranej z narządów wewnętrznych, piór lub kurzu z kurników. W czasie re- akcji po 1,5 h do 3 h w mieszaninie re- akcyjnej na drodze amplifi kacji powsta- je ponad milion kopii DNA, co pozwala na uwidocznienie wyników po rozdzia- le elektroforetycznym i barwieniu w roz- tworze bromku etydyny. Najczęściej Piśmiennictwo dostępne na stronie internetowej www.wetwterenie.elamed.pl WETERYNARIA W TERENIE y 2/2009 y 20 |
Menu
|