|
Nie obrażaj więc mojej inteligencji poprzez czynione na pokaz zaniżanie własnej.
//-->.pos {position:absolute; z-index: 0; left: 0px; top: 0px;}POST. MIKROBIOL.,2013, 52, 2, 185–200http://www.pm.microbiology.plMETAGENOM ŹRÓDŁO NOWEJ INFORMACJIO MIKROORGANIZMACH GLEBOWYCHJacek Kozdrój1*1Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja, al. Mickiewicza 24/28, 30-052 KrakówWpłynęło w lutym 2013 r.1. Wstęp. 2. Problemy z poznaniem mikrobiomu oraz próby ich przezwyciężania. 3. Metagenomika a specyficzny charakter gleby.4. Analiza genetyczna mikrobiomu. 5. Analiza funkcjonalna metagenomu. 6. Strukturalna różnorodność mikroorganizmów w różnychśrodowiskach glebowych. 7. PodsumowanieMetagenome – a new source of information about soil microorganismsAbstract:Soil environment, due to its high heterogeneity, is considered as a major reservoir of microbial genetic and metabolic diversityin the biosphere. e knowledge on this diversity is limited, because most of the soil microorganisms cannot be cultured under the usuallaboratory conditions. During the last two decades, development of methods to isolate nucleic acids from soil has opened a window toa previously unknown microbial world. In consequence, a new metagenomic approach based on the analyses of total microbial DNA hasappeared in soil studies. Total microbial DNA extracted from soil by direct or indirect methods is mostly used for amplification of markergenes (e.g. SSU rRNA) which is further di erentiated by fingerprinting (e.g. DGGE, T-RFLP) or sequenced directly. Until recently,sequencing was mainly performed a er first cloning PCR products to produce a clone library of amplicons. Lately, another approach hasbeen introduced to reduce costs and labour; it is commonly known as 454-pyrosequencing, the method that does not require cloning.ese methods as well as DNA microarrays have demonstrated an unanticipated level of microbial diversity, especially in the newlydiscovered world of the biosphere. ousands or even several hundred thousands of di erent bacterial phylotypes can be present ina gram of soil. ey belong to dozens of phyla. e molecular approach changed the picture of structural diversity of soil microbiome,also indicating that bacteria, archaea, fungi and even viruses are diverse both globally and locally. Moreover, soil metagenomics, allowsfor a comprehensive search for gene expression and metabolic activity within microbiome.1. Introduction. 2. Difficulties with microbiome analysis and attempts to overcome them. 3. Metagenomics vs. distict features of soil.4. Genetic analysis of microbiome. 5. Functional analysis of microbiome. 6. Microbial structural diversity in di erent soil environments.7. SummarySłowa kluczowe:bioróżnorodność, metagenomika, mikrobiom glebowyKey words:biodiversity, metagenomics, soil microbiome1. WstępMikroorganizmy stanowią najbardziej istotną a jedno-cześnie zróżnicowaną grupę organizmów wchodzącychw skład biosfery ziemskiej [93]. Większość bioróżno-rodności, spotykana w obrębie trzech domen: bakterii,archeonów oraz eukariotów, jest reprezentowana przezmikroorganizmy [97], które szeroko rozprzestrzeniłysię we wszystkich typach środowisk, nawet tych ekstre-malnych, w ciągu blisko czterech miliardów lat swojejewolucji. Tak długi czas umożliwił wykształcenie sięnajróżnorodniejszych mechanizmów metabolicznych,które pozwoliły im zaadaptować się do prawie każdejmożliwej niszy ekologicznej i wykorzystać do swegorozwoju różnorodne warunki środowiskowe [59].Środowisko glebowe jest uważane za najbogatszyrezerwuar różnorodnych mikroorganizmów [90], co niejest trudne do zaakceptowania, zważywszy na wysoceheterogeniczny charakter warunków fizykochemicznychpanujących w tym środowisku, a także uwzględniajączróżnicowanie typów gleb powstałych na Ziemi. Jedno-cześnie, specyficzny charakter gleby powoduje, że jestona traktowana jak swego rodzaju „czarna skrzynka”:pod względem składu mikrobiomu, aktywności i proce-sów przeprowadzanych przez występujące w niej mikro-organizmy. Nie jest pozbawiona racji myśl sformuło-wana przez L e o n a r d o d a V i n c i już w 1510 roku,że być może więcej wiemy o ruchach ciał astralnych, ani-żeli o tym, co dzieje się w ziemi pod naszymi stopami.Kilka wieków później równie sceptyczny był S e l m a nW a k s m a n, który w 1925 roku stwierdził, że: „ brakjest stosownych metod w badaniach mikrobiologicznychgleby, a te z metod stosowanych obecnie są dalekie odtego, aby w adekwatny sposób dać nam wiedzę o tym,co rzeczywiście dzieje się w glebie” [46]. Co ciekawe,ten sam mikrobiolog w 1931 roku sformułował prze-ciwną opinię, że: „zgromadzona już olbrzymia bazainformacji pozwala przedstawić jasny obraz mikrosko-powej populacji mikroorganizmów glebowych” [32].Tak diametralnie odmienne opinie mogą budzić zdzi-wienie i pytanie o stabilność naukową kryteriów badańmikrobiologicznych. Zgodnie z ustaleniem przyjętym* Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja, al. Mickiewicza 24/28, 30-052 Kraków;tel.: 12 662 40 96; e-mail: j.kozdroj@ur.krakow.pl186JACEK KOZDRÓJw 1923 roku przezBergey’s Manual,podstawą identy-fikacji nowego gatunku mikroorganizmu jest koniecz-ność sklasyfikowania jego szeregu cech morfologicz-nych, biochemicznych, fizjologicznych i genetycznychpo wcześniejszym jego wyhodowaniu na odpowiednimpodłożu [32]. Jak wielkie stanowi to wyzwanie, niechświadczy fakt znajomości tylko ponad 9000 gatunkówbakterii, wobec potencjalnych 103–107różnych drobno-ustrojów występujących w gramie gleby [27]. Ta roz-bieżność między liczbą mikroorganizmów dających sięwyhodować, a tymi, o istnieniu których świadczą wynikianaliz mikroskopowych i molekularnych, jest powodemustawicznej frustracji mikrobiologów.2. Problemy z poznaniem mikrobiomu oraz próbyich przezwyciężaniaPrzez blisko sto lat rozwoju mikrobiologii zdoby-wana wiedza o świecie mikroorganizmów dotyczyłatych, które hodowano na różnych podłożach. Podsta-wowe właściwości poszczególnych gatunków (szczepów)tych organizmów określano w oparciu o wyselekcjono-wane monokultury wyrosłe na podłożu hodowlanym.To podejście, będące konsekwencją postulatów K o c h aw badaniach nad drobnoustrojami chorobotwórczymi,zaważyło na bagatelizowaniu faktu obecności w śro-dowisku form żywych, których nie można było wyho-dować. Dominujący model badawczy w mikrobiologiikazał traktować je jako artefakty, a nie jako istotną grupęposzerzającą spektrum różnorodności mikroorganiz-mów, jak postulowali będący w mniejszości zwolen-nicy istnienia tych organizmów. Swoiste przesilenie,zmieniające utarte poglądy w mikrobiologii, nastąpiłow połowie lat osiemdziesiątych ubiegłego wieku, kiedyoficjalnie potwierdzono istnienie wyraźnej rozbieżnościmiędzy liczebnością mikroorganizmów określoną napodłożu hodowlanym oraz w preparacie mikrosko-powym, zwaną wielką anomalią liczenia metodą płyt-kową [78]. Jak się okazało, jedynie 0,1 do 1% bakteriiglebowych może wyrosnąć na tradycyjnych podłożachhodowlanych w standardowych warunkach laboratoryj-nych [44, 84]. Innymi słowy, ponad 99% różnorodnychbakterii w gramie gleby jest poza zasięgiem poznaw-czym i kryje w sobie rzeszę organizmów o być możeistotnym znaczeniu dla funkcjonowania ekosystemu.Wśród tego typu mikroorganizmów można wyróż-nić grupę, którą da się wyhodować na specyficznychpodłożach, spełniających wymogi żywieniowe organi-zmów, i umożliwiających ich wzrost w odpowiednichwarunkach fizycznych i chemicznych. Drugą grupęnatomiast stanowią mikroorganizmy, których stanfizjologiczny stanowi przeszkodę dla wzrostu na jakim-kolwiek podłożu hodowlanym i dlatego są znane tylkow postaci sekwencji nukleotydowych rRNA (ryboty-pów), jak np. WS3, OP11, OD1 lub BRC-1. Tutaj należąteż powszechne w glebie mikroorganizmy, występującew stadium spoczynkowym o ograniczonej aktywnościkomponentów komórkowych warunkujących wzrost– w przypadku bakterii są to formy drobne (ultra mikro-bakterie). Te drzemiące formy drobnoustrojów w sprzy-jających warunkach podlegają wybudzeniu, a więc teo-retycznie mogą być też wyhodowane na odpowiednimpodłożu. Jednakże są też takie mikroorganizmy glebowewidoczne pod mikroskopem, które można określić jakotrwale niezdolne do wzrostu (nonviable) o nieodwra-calnych zmianach komórkowych, lub będące w faziezamierania [52].Manipulacje składem podłoża hodowlanego w kie-runku obniżenia jego troficzności, dobór odpowiedniegopH i temperatury, wydłużanie czasu inkubacji, stosowa-nie polimerowego substratu wzrostowego (np. ksylanu)oraz żelowych mikrogranul do immobilizacji komórekizolowanych ze środowiska przed umieszczeniem ichw podłożu hodowlanym, pozwalają znacząco posze-rzyć spektrum możliwych do wyhodowania mikroor-ganizmów glebowych [10, 40, 41, 101]. Wolno rosnącebakterie glebowe z typów:Acidobacteria, Chloro exi,Actinobacteria(podklasaRubrobacteridae), Plancto-mycetes, Bacteroidetes, FirmicutesorazProteobacteria,niewykrywalne według tradycyjnej procedury, mogąbyć dostrzeżone w postaci mini kolonii (25–200 µm) po12 tygodniowej hodowli na podłożu zawierającym ksy-lan jako substrat pokarmowy oraz gellan (polisacharydprodukowany przezPseudomonas elodea)jako środekzestalający zamiast agaru [16]. Ten postęp w metodachhodowania pospolitych w glebie bakterii, wykrywanychjedynie na podstawie sekwencji nukleotydowej genu 16SrRNA, daje nadzieje na uzyskiwanie monokultur tychorganizmów, które wymykały się spod tradycyjnej prak-tyki laboratoryjnej mikrobiologów. Dzięki temu moż-liwe jest ich pełne identyfikowanie do gatunku i bliższepoznanie ich właściwości fizjologicznych i potencjalniezajmowanej niszy ekologicznej w glebie.Przytłaczająca jest jednakże dysproporcja międzyliczbą mikroorganizmów możliwych do wyhodowa-nia, a tymi reprezentowanymi tylko przez fragmentygenów kwasów rybonukleinowych małej podjednostkirybosomów (SSU rRNA), które W o e s e i F o x [96]zaproponowali jako chronometry ewolucyjne organiz-mów. To odkrycie dało podstawę do sformułowaniaparadygmatu biologicznego o podziale świata żywegona trzy domeny:Bacteria, ArchaeaorazEucarya[97].Norman P a c e wraz ze współpracownikami, jakopierwszy wykorzystał markery komórkowe, geny 5Soraz 16S rRNA, do charakteryzowania różnorodnościmikroorganizmów prokariotycznych w środowiskubez potrzeby ich hodowania [60, 77]. Początkowo takaprocedura wymagała bezpośredniego sekwencjonowa-nia RNA lub jego odwrotnych transkryptów w postaciMETAGENOM ŹRÓDŁO NOWEJ INFORMACJI O MIKROORGANIZMACH GLEBOWYCH187kopii DNA (cDNA), co było technicznie kłopotliwe.Znaczący postęp dokonał się wraz z rozwojem techno-logii PCR i skonstruowaniem starterów, umożliwiają-cych amplifikację prawie kompletnego genu rRNA [29].To zintensyfikowało wykrywanie coraz to nowych tak-sonów wraz z badaniem różnych biotopów ziemskichprzy użyciu tej nowej techniki [3, 32, 72]. Gromadzonesekwencje nukleotydowe SSU rRNA w bazie RibosomalDatabase Project (RDP) początkowo w liczbie kilkusetpozycji, szybko uległy zwielokrotnieniu do 10 tysięcyw roku 1998, 72 626 w 2003, czy 2 639 157 w grudniu2012 (RDP-10.31). W tej ostatniej wersji bazy RDPbakterie są reprezentowane przez 1 186 838 sekwencjinukleotydowych, natomiast archeony obejmują jedy-nie 22 615 pozycji. Wśród sklasyfikowanych sekwencjidominująFirmicutes(407 377),Proteobacteria(322 871),Actinobacteria(176 308) orazBacteroidetes(135 261).Rozmiar dysproporcji, między światem mikroorga-nizmów potencjalnie istniejących, a tymi, które da sięwyhodować, został uwidoczniony po zastosowaniumetody pomiaru tempa reasocjacji jednoniciowegoDNA, powstałego po denaturacji całkowitego DNAw wysokiej temperaturze, wyekstrahowanego z mikroor-ganizmów glebowych [83]. Okazało się, że w gramie róż-nych gleb może występować od 1000 do 40 000 genomówmikroorganizmów, co przekracza przeszło 200-krotnieliczbę organizmów otrzymanych w hodowli [46]. Dal-sze postępy w analizie reasocjowanego DNA pozwoliłyoszacować różnorodność mikroorganizmów prokario-tycznych w gramie gleby na poziomie od 500 tysięcydo 10 milionów genomów [27]. W tym oceanie różnychgenomów identyfikacja do konkretnych taksonów jestwysoce utrudniona. Jedyną pomocą są bazy sekwencjinukleotydowych genów SSU rRNA i opracowywane naich podstawie znakowane sondy filogenetyczne, któreumożliwiają także ilościowe oznaczenia występowaniaróżnych taksonów (gatunków), analizując bezpośredniopróbkę pobraną ze środowiska za pomocą metody uo-rescencyjnej hybrydyzacjiin situ[28].Pomimoznaczącego postępu w badaniach mikro-organizmów, oraz aby uniknąć konsekwencji jedyniekatalogowania różnorodnych sekwencji nukleotydo-wych genów SSU rRNA znajdowanych w środowisku,mikrobiolodzy podjęli się opracowania metod, umożli-wiających poznanie genetyki, fizjologii i ekologii drob-noustrojów nie poddających się hodowli.3. Metagenomika a specyficzny charakter glebyPełna charakterystyka organizmów wymaga pozna-nia sekwencji nukleotydowych ich genomów. Obecniew pełni znanych jest 2809 genomów wirusów, 2096 geno-mów bakterii, 153 genomów archeonów oraz 37 geno-mów eukariotów (wg IMG/M, Integrated MicrobialGenomes with Microbiome Samples). Liczba ta jestznikoma, aby wykorzystać ją, jako podstawę do analizyróżnorodności mikroorganizmów w próbce środowisko-wej, w oparciu o poszukiwanie sekwencji DNA odpowia-dających znanym genomom. W dodatku taka procedurabyłaby bardzo żmudna, kosztochłonna, i co najważniej-sze, w niewielkim stopniu uzupełniałaby tradycyjną ana-lizę mikrobiologiczną. Sytuacja zmienia się, jeśli zamiastsekwencjonowania poszczególnych genomów, analiziepodda się zbiorczo cały DNA izolowany z próbki śro-dowiskowej, reprezentujący wszystkie mikroorganizmy.Ideę analizy zbioru podobnych, ale nie identycznychjednostek (genomów), stanowiących razem metagenom,wprowadziła, pod postacią metagenomiki, H a n d e l s -m a n i wsp. [33], jako sposób na poznanie nieznanychmikroorganizmów glebowych i ich zdolności syntezy no-wych produktów (np. antybiotyków). Klasyczna analizametagenomiczna jest oparta na: izolacji DNA z próbkiśrodowiskowej, klonowaniu fragmentów DNA w odpo-wiednim wektorze, transformowaniu otrzymanych re-kombinantów do stosownego gospodarza bakteryjnego,a następnie analizy przesiewowej uzyskanych transfor-mantów bakterii. Skonstruowana w ten sposób bibliotekaklonów DNA jest dalej analizowana pod kątem zawar-tości sekwencji nukleotydowych różnych genomów,wykorzystując filogenetyczne markery (najczęściej gen16S rRNA), lub ekspresji funkcjonalnych genów kodu-jących różne enzymy (np. lipazy, amylazy czy proteazy),genów odpowiedzialnych za biosyntezę nowych anty-biotyków (np. turbomycyny A i B), albo też DNA klo-nów poddawane jest losowemu sekwencjonowaniu [32,14]. Pionierskie prace, oparte na idei klonowania śro-dowiskowego DNA sformułowanej przez P a c e i wsp.[60], dotyczyły: (a) analizy społeczności pikoplanktonumorskiego przy użyciu wektora fagowego [72]; (b) kon-strukcji pierwszej biblioteki metagenomowej konsorcjummikroorganizmów, w tym o aktywności celulolitycznej,namnożonych na wysuszonej trawie w laboratorium[35]; (c) konstrukcji pierwszej biblioteki otrzymanejbezpośrednio ze społeczności prokariotów morskich,i stwierdzenia w genomach przedstawicieliGamma-proteobacteriaobecności genu kodującego bakterioro-dopsynę, wcześniej znanego tylko u archeonów [79].Gleba stanowi szczególne wyzwanie dla analizy meta-genomicznej. Jest to związane z jej budową strukturalną,składem chemicznym i niejednolitym rozmieszczeniemmikroorganizmów, zależnym z kolei od tych pierwszychczynników. Różnie rozwinięta, w zależności od typugleby, struktura agregatowa oparta na składnikach mine-ralno-organicznych stanowi skomplikowaną mozaikęmikrobiotopów o zmiennych czasowo i przestrzenniewarunkach fizykochemicznych. W tych mikrobioto-pach, o rozmiarach od 2 do 20 µm lub mniejszych niż2 µm, drobnoustroje występują na powierzchni cząstekpiasku lub kompleksów iłowo-organicznych, silnie do188JACEK KOZDRÓJnich przylegając w postaci mikrokolonii lub zasiedlająmieszczące się w nich mikropory, preferując te o śred-nicy 2 µm. Łączna powierzchnia, jaką zajmują mikro-organizmy, jest znikoma i stanowi jedynie od tysięcz-nych do milionowych części procenta ogółu dostępnejpowierzchni, biorąc pod uwagę fakt, że powierzchniafrakcji ilastej może zajmować do 103m2w gramie gleby[52]. Mikroagregaty, połączone egzopolisacharydamiprodukowanymi przez drobnoustroje, a także strzęp-kami grzybów, tworzą makroagregaty, wewnątrz i mię-dzy którymi występują makropory o średnicy powy-żej 6 µm. Środowiskiem wyraźnie stabilniejszym dlamikroorganizmów pod względem: zasobności w wodę,zawartości pokarmu, zaadsorbowanych makrocząste-czek (białka, DNA) i toksycznych gazów (CO2, NOx),a także zagrożenia ze strony drapieżnych pierwotnia-ków, wazonkowców, skoczogonków lub roztoczy, sąmikroagregaty. Dlatego też strukturalna różnorod-ność drobnoustrojów, czyli mozaika różnych popula-cji składających się na daną społeczność, jest znaczącoodmienna w mikro i makroagregatach glebowych [51].Przy badaniu tak złożonego środowiska pojawia sięproblem, jaką strategię poboru próbek, jeżeli chodzio analizowany obszar, ich liczbę oraz wielkość, zasto-sować, aby uzyskać reprezentatywny dostęp do jaknajwiększej liczby mikroorganizmów występującychw danej glebie. Niedocenianie tego problemu, zwłasz-cza w przypadku stosowania metod molekularnychw odniesieniu do bezpośrednich ekstraktów DNA/RNA,może skutkować zafałszowanym obrazem strukturalnejróżnorodności i aktywności metabolicznej mikrobiomu.Analizy mikrobiologiczne gleby muszą uwzględniaćzmienność bioróżnorodności w czasie [95] mierzonejw skali wieloletniej, rocznej (efekt pór roku), dziennejczy nawet godzinowej (pora dnia). Drugim faktem,który należy uwzględniać, jest zmienność bioróżno-rodności w przestrzeni w skali jednego pola lub więk-szej (regionu, kontynentu), gdzie duże znaczenie majązmieniające się warunki edaficzne, głównie pH [5, 51,70]. Ta zmienność implikuje dokonywanie losowegopoboru wielu próbek (5–10), na obszarze kilkudziesię-ciu metrów kwadratowych danego pola (terenu), któremogą być analizowane osobno lub razem po zmiesza-niu. W tym ostatnim przypadku obserwuje się mniejszązmienność warunków fizycznych gleby oraz struktural-nej różnorodności mikrobiomu [2]. Przy porównywa-niu różnorodności mikroorganizmów, występującychw różnych miejscach, musi być uwzględniony stopieńzmienności tej różnorodności w obrębie pojedynczegomiejsca, a więc bardzo ważna jest liczba wykonanychpowtórzeń [64]. Pojedyncze próbki, dające reprezenta-tywny obraz mikrobiomu glebowego, mają minimalnąwielkość między 0,125 a 0,250 g [43, 65], jakkolwiek nie-kiedy lepiej jest zastosować większe 10-g próbki zamiast1-g lub 0,1-g, aby zmniejszyć stopień zmienności struk-tury społeczności mikroorganizmów obserwowany mię-dzy próbkami [57]. Znalezienie złotego środka w tymprzypadku opiera się na: rodzaju badanych populacjimikroorganizmów – dominujące lub rzadkie (tu lepiejzastosować większe próbki), a także samej glebie – efek-tywność ekstrakcji DNA zmienia się w zależności odtypu gleby [51]. W mikroskali glebowej drobnoustrojecharakteryzują się wybitnie nierównomiernym roz-mieszczeniem między makro i mikroagregatami [54].Wiele rzadkich populacji może być przeoczonych, jeślibadania nie będą prowadzone na poziomie tych agrega-tów, z uwagi na maskujący efekt dominujących populacjiwidoczny podczas analizy w makroskali tradycyjnychpróbek glebowych [43].Wysoce heterogeniczny charakter gleby, pod wzglę-dem struktury oraz rozmieszczenia mikroorganizmów,stanowi olbrzymie utrudnienie dla efektywnej ekstrakcjiDNA lub RNA metagenomu glebowego. Zagadnienieto zostało szerzej opisane we wcześniejszej pracy prze-glądowej [45]. Najogólniej, kwasy nukleinowe ekstra-huje się z gleby, stosując podejście bezpośrednie lubpośrednie, kiedy DNA lub RNA izoluje się z wcześniejwyodrębnionej frakcji komórkowej drobnoustrojówglebowych. Otrzymany metagenomowy DNA oczywiś-cie nie jest jednakowy pod względem ilościowym, i coważniejsze, jakościowym (czystość preparatu, stopieńpofragmentowania cząsteczki – a więc liczba i wielkośćfragmentów DNA). Bezpośrednia ekstrakcja daje od10 do 100 razy więcej DNA, który może być bardziejzanieczyszczony związkami humusowymi, zewnątrz-komórkowym DNA oraz silniej pofragmentowany nakrótsze odcinki (0,5–20 kpz), niż w przypadku izo-lacji DNA z frakcji komórkowej (10–50 kpz, a nawet150–1000 kpz). Ta procedura jest jednakże najczęściejstosowana w analizie metagenomu glebowego, cho-ciaż rzadko można uzyskać więcej niż 60% ogólnejpuli DNA mikroorganizmów obecnych w danej glebie,który jeszcze nawet w 30% może być tracony podczasetapów oczyszczania [51]. Niekiedy korzystniejsze bywastosowanie procedury pośredniej ekstrakcji DNA, alei w tym przypadku należy liczyć się z tym, że trudno jestuzyskać więcej niż 20–50% bakteryjnego DNA, z uwagina silną adsorpcję komórek do cząstek glebowych [67].Szereg specyficznych przeszkód charakterystycznychdla każdej ze strategii izolacji metagenomowego DNApowoduje, że uzyskiwany obraz różnorodności mikro-biomu glebowego jest mimo wszystko fragmentarycznyi zależy w dużej mierze od rodzaju mikroorganizmówi ich podatności na lizę, rozmieszczenia oraz stopniadostępności komórek i uwolnionego DNA w strukturzegleby. W takiej sytuacji, pewnym rozwiązaniem, umożli-wiającym uzyskanie w miarę wiarygodnego obrazu bio-różnorodności, może być przeprowadzenie sukcesyw-nego kilkakrotnego ekstrahowania DNA lub izolowaniakomórek z tej samej próbki glebowej [23].METAGENOM ŹRÓDŁO NOWEJ INFORMACJI O MIKROORGANIZMACH GLEBOWYCH1894. Analiza genetyczna mikrobiomuRóżnorodność mikroorganizmów w glebie może byćrozpatrywana pod kątem ogólnej oceny struktury mikro-biomu i porównania między różnymi próbami, lub teżmoże dotyczyć dogłębnej identyfikacji składu społeczno-ści drobnoustrojów zasiedlającej daną glebę. W związkuz tym należy zastosować różne strategie do sporządzaniapróbek oraz ekstrakcji DNA, jak wyżej opisano. Co wię-cej, odmienny charakter będzie też mieć analiza meta-genomiczna w obu przypadkach. Jeśli celem jest pozna-nie ogólnej struktury społeczności mikroorganizmówi ewentualnych zachodzących w niej zmian, wystarcza-jące jest wykorzystanie znanych metod „fingerprinto-wych”, jak np. DGGE/TGGE czy T-RFLP [46]. Ponieważwiększość z tych metod opiera się na wcześniejszej ampli-fikacji filogenetycznych markerów przez PCR, należybyć świadomym pewnych problemów specyficznych dlareakcji PCR. Przykładem istotnego problemu jest prefe-rencyjne amplifikowanie fragmentów genowych, pocho-dzących od populacji będących w mniejszości, jeśli takiefragmenty charakteryzują się ponad przeciętną efektyw-nością przyłączania starterów i polimerazy DNA [91].W konsekwencji otrzymane profile DNA nie będą rzetel-nie odzwierciedlać składu analizowanego mikrobiomu.Charakterystyczną cechą metod „fingerprintowych” jesttakże to, że przedstawiony przez nie obraz mikrobiomuobejmuje ograniczoną liczbę dominujących populacji. Tepopulacje mogą być identyfikowane poprzez klonowanie,a następnie sekwencjonowanie poszczególnych fragmen-tów DNA pochodzących od różnych mikroorganizmów.Nowa generacja metod „fingerprintowych” umożliwiaidentyfikację bakterii i archeonów glebowych w oparciuo mikromacierze genowe, które zawierają od 500 000 do110 000 025-merowych sond oligonukleotydowych hybry-dyzujących z metagenomowymi fragmentami genówSSU rRNA po ich amplifikacji PCR, lub bezpośrednioz rRNA, albo dwuniciowym komplementarnym DNA(dscDNA). Daje to możliwość wykrycia od około 9 000(PhyloChip G2) do ponad 50 000 (PhyloChip G3) OTU(operational taxonomic unit) drobnoustrojów potencjal-nie obecnych w metagenomie glebowym [1, 11, 17, 74].Szczegółowe poznanie składu mikrobiomu glebo-wego wymaga zastosowania innego podejścia anali-tycznego w stosunku do wyekstrahowanego z glebymetagenomowego DNA. Jednym ze sposobów, jed-nocześnie najczęściej stosowanym, jest wykorzystaniefilogenetycznego markera w postaci genu SSU rRNA(16S u prokariotów lub 18S u eukariotów), który poamplifikacji PCR podlega klonowaniu celem otrzyma-nia biblioteki reprezentującej wszystkie mikroorganizmyobecne w badanej glebie. Następnie poszczególne sklo-nowane fragmenty DNA są sekwencjonowane i pod-dawane bioinformatycznej analizie. Drugim sposobem,dzięki postępowi technologicznemu, jest analizowanie,na podobnej zasadzie, losowych fragmentów DNA lubcałych metagenomów. W tym przypadku pofragmen-towany materiał genetyczny jest swoistą mieszaninąfragmentów DNA, w której szereg sekwencji nukle-otydowych częściowo się pokrywa. W związku z tym,po sekwencjonowaniu wystarczającej liczby małychodcinków DNA istnieje możliwość odtworzenia dużychfragmentów DNA, wystarczających do identyfikacji tak-sonów, lub będących wręcz rekonstrukcją kompletnegogenomu [99]. Oczywiste jest, że w tej procedurze będąwykrywane, w przeważającej mierze, najliczniej repre-zentowane organizmy, dlatego tak ważne jest posługi-wanie się większymi próbkami gleby w powtórzeniach,co jest często trudne do spełnienia, aby wychwycić takżesekwencje DNA pochodzące od rzadkich taksonów.Pewną pomocą jest przypadkowa natura sekwencjo-nowania typu „shotgun”, która zapewnia, że wiele tychorganizmów jest reprezentowanych przynajmniej przezjakieś małe fragmenty sekwencji nukleotydowych.Niezależnie od strategii zastosowanej do analizymetagenomu, w klasycznej postaci niezbędny etap klo-nowania może dotyczyć małych lub dużych fragmentówDNA, które też są wstawiane w różne wektory. Biblio-teka małych wstawek dotyczy fragmentów DNA o wiel-kości do 20 kpz wprowadzonych do plazmidów, nato-miast duże fragmenty o wielkości do 40 kpz wstawianesą do fosmidów lub kosmidów, a te o wielkości jeszczewiększej, przekraczającej nawet 100 kpz, znajdują sięw sztucznym chromosomie bakteryjnym BAC. Wspom-niane wektory posiadają zalety i wady oraz różnią sięprzeznaczeniem (Tab. I), a ich użycie zależy od: jakościizolowanego glebowego DNA, wymagań odnośnie prze-ciętnej wielkości wstawek w bibliotece, wymagań w sto-sunku do liczby kopii wektora w komórce gospodarza,rodzaju samego gospodarza, oraz strategii użytej doprzeszukiwania klonów [14]. Niemal wszystkie biblio-teki klonów w początkowym etapie tworzenia, a takżew celu przechowywania sekwencji DNA metagenomu,wykorzystują jako gospodarza bakterięEscherichia coli.W przypadku klonowania fragmentów DNA mikro-organizmów glebowych, zwłaszcza w celu późniejszejanalizy funkcjonalnej genów, jako gospodarzy wybierasię występujące w glebie bakterie z rodzajuPseudo-monaslubStreptomyces[12, 92]. KomórkiE. coliczę-sto nie mają odpowiedniej maszynerii transkrypcyjnotranslacyjnej (np. efektywne promotory, czynniki sigmaczy białka regulatorowe), która umożliwiałaby ekspre-sję genów lub operonów pochodzących od członkówmikrobiomu glebowego często różniących się znacz-nie zawartością zasad G + C w genomie oraz systememwydzielniczym białek, co skutkuje nikłą ilością (niekiedymniej niż 0,01%) uzyskanych pozytywnych klonówpodczas jednej rundy przeszukiwania biblioteki [13,30]. Konstruowane biblioteki metagenomu glebowegosą z reguły bardzo obszernymi kolekcjami fragmentów
|
Menu
|