|
Nie obrażaj więc mojej inteligencji poprzez czynione na pokaz zaniżanie własnej.
M
IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 1 część teoretyczna ___________________________________________________________________________ Ć WICZENIE 1: R ODZAJE I Z ASADY P RZYGOTOWYWANIA P REPARATÓW M IKROBIOLOGICZNYCH Technika wykonania preparatów mikroskopowych Małe wymiary komórek mikroorganizmów nie pozwalają na ich obserwację okiem nieuzbrojonym. Do badania morfologii, oceny liczebności czy żywotności drobnoustrojów stosuje się obserwacje mikroskopowe preparatów wykonanych bezpośrednio z materiału badanego (np. preparaty odciskowe) lub z hodowli. Przygotowane preparaty można oglądać bezpośrednio pod mikroskopem lub dodatkowo je wybarwić. Celem barwienia jest ułatwienie: • obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych (m.in. kształt, wielkość, wzajemny układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych układach, obecność otoczek, zdolność ruchu, ilość i rozmieszczenie rzęsek/wici, sposób rozmnażania się – przez podział, tworzenie pą zków, zarodników i form przetrwalnych), c Barwienie drobnoustrojów jest procesem fizykochemicznym, który polega na wniknięciu barwnika do wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu z cytoplazmą. Do barwienia mikroorganizmów najczęściej stosuje się zasadowe barwniki ( błękit metylenowy, zieleń malachitowa, fuksyna zasadowa, czerwień obojętna, fiolet krystaliczny, goryczkowy i metylowy ), wykorzystując ich powinowactwo do kwaśnej cytoplazmy komórkowej. Rzadziej używane są barwniki kwaśne ( fuksyna kwaśna, eozyna, erytrozyna, barwnik Kongo i nigrozyna ) lub obojętne mieszaniny barwników kwaśnych i zasadowych (np. barwnik Giemsy ). W zależności od sposobu barwienia wyróżniamy barwienia przyżyciowe i barwienie preparatów utrwalonych . 1 . Przygotowanie preparatów przyżyciowych Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu rozmnażania, a czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się obserwacje drożdży i pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze względu na małe rozmiary, ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości. Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku podstawowym (w kropli spłaszczonej), a w przypadku badania ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem rozmnażania drożdży preparaty wykonujemy na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą Lindnera (w kropli wiszącej). 1.1. Wykonywanie preparatu w kropli spłaszczonej Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte z alkoholu, dokładnie wytarte i trzykrotnie przeciągnięte nad płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej hodowli __________________________________________________________________________________________ K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 1 • liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych). M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 1 część teoretyczna ___________________________________________________________________________ drobnoustrojów i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym, opuszczając je ukośnie w celu wyeliminowania pęcherzyków powietrza. Nadmiar płynu osusza się bibułą filtracyjną (rys. 1.). Przy sporządzaniu preparatu z hodowli na podłożu stałym lub z produktów o konsystencji mazistej należy nanieść na szkiełko najpierw kroplę jałowej wody destylowanej, a następnie pobrany za pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej kropli. Całość nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po przygotowaniu, żeby nie dopuścić do przeschnięcia materiału. Najlepszą jakość uzyskuje się przy preparatach cienkich, blisko brzegu kropli. Rys.1. Schemat wykonania preparatu przyżyciowego 1.2. Wykonywanie preparatu w kropli wiszącej (w komorze Lindnera) Komora Lindnera to szkiełko podstawowe z wgłębieniem. Brzegi wgłębienia komory Lindnera smaruje się wazeliną (1). Na środku odtłuszczonego szkiełka nakrywkowego umieszcza się kroplę badanej hodowli (2), szkiełko szybko odwraca się i przykleja do brzegów wgłębienia w ten sposób, aby kropla wisiała w powietrzu mniej więcej na środku wgłębienia (3). Lekko docisnąć szkiełko, wazelina uszczelnia i spowalnia wysychanie preparatu (rys. 2.). Najlepiej oglądać preparat blisko brzegu kropli gdzie jest najcieńszy. Rys. 2. Preparat w komorze Lindnera __________________________________________________________________________________________ K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 2 M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 1 część teoretyczna ___________________________________________________________________________ 1.3. Barwienie preparatów przyżyciowych Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać barwienie obok kropli z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Stosowane barwniki nie mogą być toksyczne i muszą się charakteryzować wysoką kontrastowością. Mimo że używa się ich w bardzo dużym rozcieńczeniu i tak wywołują zahamowanie rozmnażania. Przykłady: • barwienie błękitem metylenowym (rozcieńczenie 1:10 000) pozwala ocenić żywotność drożdży; barwnik przenika do wnętrza martwej komórki, która barwi się na ciemnoniebiesko, • barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży substancji zapasowych – glikogenu, który barwi się na brunatno, a cytoplazma komórki jasnożółto, • barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków beztlenowych wykryć granulozę - cukier stanowiący substancję zapasową tych bakterii. Mechanizm barwienia przyżyciowego może być różny i nie jest on jeszcze do końca poznany. Prawdopodobnie jest wynikiem: - chemicznego wiązania ze składnikami komórki, - elektroadsorpcji barwnych anionów i kationów, - rozpuszczania się barwnika w określonych składnikach chemicznych komórki. 2. Wykonanie preparatów utrwalonych Preparaty utrwalone możemy podzielić na: • Trwałe – mogą być używane wielokrotnie przez długi czas, • Półtrwałe – jednorazowego użytku. 2.1. Preparaty półtrwałe Preparaty półtrwałe uzyskuje się po utrwaleniu i wybarwieniu drobnoustrojów na szkiełku podstawowym (rys. 3.). Nie zatapia się ich w balsamie. Wykonanie rozmazu Technika zależy od konsystencji badanego materiału. Jeśli mamy do czynienia z pożywką płynną, to sporządzenie rozmazu polega na rozprowadzeniu kropli cienką warstwą na środku odtłuszczonego szkiełka podstawowego. Rozmaz wykonuje się ezą, suszy na powietrzu. Jeśli materiał pochodzi z hodowli stałej należy najpierw na szkiełku umieścić kroplę wody i następnie – pobrany ezą materiał – rozprowadzić w tej kropli. Z mięsa i produktów mięsnych, ryb, żółtego sera wykonuje się preparaty bezpośrednio z badanych próbek. W tym celu wycięty jałowym skalpelem kawałek (np. mięsa, sera twardego, wędliny) przenieść jałową pincetą na szkiełko podstawowe i odcisnąć na nim wyraźny ślad, cienki i bez wolnych przestrzeni. Po wykonaniu rozmazu preparaty zostawiamy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. __________________________________________________________________________________________ K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 3 M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 1 część teoretyczna ___________________________________________________________________________ Rys. 3. Schemat wykonania preparatu półtrwałego Utrwalanie preparatów Utrwalenie przerywa zachodzące w komórkach procesy fizjologiczne i pozwala zachować strukturę komórek, zapobiegając zmianom pośmiertnym. Ma na celu: zabicie komórek drobnoustrojów; przyklejenie się komórek do powierzchni szkiełka – nie spłukuje ich barwnik ani woda; odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów związków, z którymi łączy się barwnik. Utrwalanie możemy wykonywać metodą: termiczną – wyschnięty preparat przeprowadzamy 3-krotnie w pozycji poziomej (rozmazem do góry) przez płomień palnika chemiczną – do badania struktur komórkowych , przy użyciu 60–70% alkoholu, 10% formaliny, sublimatu lub mieszaniny eteru i alkoholu (1:1). W tym celu na wysuszony rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5 – 10 min. zlewa się utrwalacz, suszy na powietrzu i barwi jedną z podanych metod. Używając sublimatu lub formaliny należy preparat dobrze przemyć wodą i wysuszyć. Preparaty utrwalone barwi się, co pozwala na określenie kształtu drobnoustrojów, a także obserwację układów komórek i struktur komórkowych. __________________________________________________________________________________________ K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 4 M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 1 część teoretyczna ___________________________________________________________________________ Barwienia preparatów utrwalonych W mikrobiologii mają zastosowanie następujące sposoby barwienia: barwienie proste – gdzie używamy jednego roztworu barwnika, barwnik zlewa się, spłukuje wodą, alkoholem lub acetonem i osusza bibułą; stosowane w celu ustalenia kształtu i układu komórek, np. barwienie fioletem krystalicznym lub błękitem metylenowym barwienie złożone – z użyciem co najmniej 2 roztworów barwników, barwienie albo w ściśle określonej kolejności albo ich mieszaniną; np. barwienie metodą Grama W zależności od stosowanych barwników, można wyróżnić 3 sposoby barwienia: barwienie pozytywowe – polegające na zabarwieniu komórek, podczas gdy tło zostaje bezbarwne; może być proste lub złożone, barwienie negatywowe – uzyskanie kontrastu między ciemnym tłem a nie zabarwionymi komórkami; stosowane jest zwykle do barwienia krętków i otoczek bakterii; wykorzystuje się roztwór nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny, rozmaz wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z barwnikiem, nie utrwala się, tylko od razu po wysuszeniu ogląda pod mikroskopem, może być proste lub złożone, barwienie pozytywowo-negatywowe – połączenie powyższych metod, najpierw wykonuje się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu dobarwia się barwnikiem pozytywowym. 2.2. Preparaty trwałe Przygotowanie preparatów trwałych obejmuje kilka etapów, z których najistotniejsze to: utrwalenie, barwienie i zatopienie preparatu. Utrwalenie materiału na szkiełku podstawowym można dokonać za pomocą czynników fizycznych (ogrzewanie szkiełka z rozmazem zawiesiny drobnoustrojów w płomieniu palnika) lub chemicznych (etanol, metanol, formalina, kwas pikrynowy, dwuchromian potasu). Po wyschnięciu preparat barwi się, a następnie pokrywa balsamem kanadyjskim. Po przykryciu szkiełkiem nakrywkowym, lekko ogrzewa do rozpuszczenia balsamu, dociska szkiełko i usuwa nadmiar balsamu. Tak przygotowany preparat może być przechowywany przez długi czas. __________________________________________________________________________________________ K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 5 |
Menu
|