|
Nie obrażaj więc mojej inteligencji poprzez czynione na pokaz zaniżanie własnej.
Western-blot Z Wikipedii Skocz do: , Żel poliakrylamidowy z rozdzielonymi białkami, zabarwiony Coomassie Brilliant Blue Western-blot - metoda stosowana w , służąca do wykrywania określonych . Rozdziela białka według ich mas oraz natywne (niezdenaturowane) według ich struktury 3-D, za pomocą w żelu (zwykle ). Później białka są przenoszone na membranę (zwykle lub PVDF). Obecność odpowiednich białek jest sprawdzana za pomocą barwników takich jak Ponceau S, czerń amidowa czy Coomassie Brilliant Blue lub za pomocą przyłączających się do ich . Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje "zablokowana" przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle , bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego , często z dodatkiem (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną. Analogicznie do metody w metodzie Western-blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał - nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia). Przeciwciała są znakowane zwykle (np. chrzanową lub ), fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku stosowania wizualizacji przez luminescencję lub stosowanie izotopów, obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej.
Elektroforeza []Z Wikipedii Skocz do: , Aparat do pionowej elektroforezy żelowej Aparat do poziomej elektroforezy żelowej Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w i , zwłaszcza w . Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich w . Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki. Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie nie używaną), żelową i kapilarną. Spis treści[ · · · ]W elektroforezie ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z , , lub (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu - kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (rzadziej jest to słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu - studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w o większej gęstości (np. w ), dzięki czemu rozpływa sie na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd . Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną, , do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące rzędu 50-3000 . Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki w oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne (tzw. markery) o znanej mobilności elektroforetycznej. Fragment żelu poliakrylamidowego z oligonukleotydami analizowanymi w świetle UV. Elektroforeza przebiegała od góry ku dołowi. Poszczególne ścieżki obrazują proces przyłączania barwnika , co zmieniało mobilność oligomerów i ich własności . Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj ) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów znakowanych uzyskuje się przez zaczernienie (). W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi . Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania , lub wyekstrahowanych z komórek lub . Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru i badania syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać , np. przy pomocy SDS (w przypadku białek) lub (w przypadku DNA lub białek). Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak przestrzenna sieć. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki bo łatwiej się przeciskają przez tą sieć, większe się opóźniają. Plusowy prąd uruchamia te które 'utknęły' po drodze i daje lepszej jakości rozdział.
· (BP) · (XC) · . Przykładowe substancje wybarwiające żel · · · · Elektroforegram CE ]Elektroforeza kapilarna (CE, od ang. Capillary Electrophoresis), zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak ). Metoda ta jest często stosowana w do analizy , znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu . Kapilara ta wypełniana jest buforem. Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie (do 30 ). U wylotu kapilary zamontowany jest , który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z . Dla układu wodnego jest to zwykle . Technika ta umożliwia rozdzielanie i organicznych i nieorganicznych. Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC). W tej technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony jonowy (np. ... |
Menu
|